利用添加剂提高内切纤维素酶制剂的热稳定性

jinqijixie
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利用添加剂提高内切纤维素酶制剂的热稳定性

帖子jinqijixie » 周一 8月 08, 2016 1:31 am











随着酶制剂工业的发展,一些大规模生产的微生物酶制剂多倾向采用液态酶制剂,一方面为了消除粉末状的固体酶制剂对人体呼吸系统的伤害和对环境的污染,另一方面可以充分第发挥液态酶生产工艺简单、酶得率高、机械化程度高、能耗低等优点。但是液态酶不稳定,易失活,所以经常采用添加稳定剂和防腐剂的方法来保持液态酶的稳定性,其中添加稳定剂的方法更简单易行,成本也低,所以国内外逐渐开始尝试使用添加稳定剂的方法以长期有效地保持酶的稳定性。
  纤维素酶作为一种可以降解纤维素的生物催化剂,在食品工业、畜牧业、纺织业、医药、生物转化和环境保护等行业中应用十分广泛。但由于纤维素酶的稳定性差,使得在工业化生产纤维素酶的过程中存在很大困难,因此提高纤维素酶的稳定性刻不容缓。在目前的研究领域中,可以提高酶稳定性的方法有很多,其中包括固定化法、化学修饰法、筛选耐热酶产生菌株法、添加稳定剂法和基因工程技术法。其中添加稳定剂可以改变酶的微环境,进而提高酶的稳定性,常用的稳定剂有多元醇、糖类、无机盐、氨基酸及其衍生物、多聚物和甘油等。

  前期的研究中,我们已构建了高水平表达内切纤维素酶的酵母工程菌株,但其分泌产生的内切纤维素酶稳定性较差,为了改善内切纤维素酶的储存稳定性,本研究对发酵制备的液态内切纤维素酶进行稳定剂的选择与优化,研究多元醇、糖类、金属离子以及蛋白质对液态内切纤维素酶酶制剂的热保护作用,并通过正交试验得出最佳的酶稳定剂配方,为该酶液态酶制剂的工业化制备及应用提供依据。
材料与方法
  1.1 材料
  实验室前期构建的高水平表达内切纤维素酶的酵母工程菌株。
  1.2 试剂
  酵母浸膏(Yeast Extract);胰蛋白胨(Tryptone);YNB;甘露醇、MgCl2、半乳糖等均为分析纯。
  1.3 培养基
  1.3.1 BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium)培养基
  2%胰蛋白胨,1%酵母抽提物,1.34%YNB,1%甘油,100 mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0,5×104 Pa灭菌30 min,4℃保存备用,使用时添加4×10-7生物素。
  1.3.2 BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)培养基
  2%胰蛋白胨,1%酵母抽提物,1.34%Y N B , 0 . 5 % 甲醇, 1 0 0 m m o l / L 磷酸钾缓冲液pH6.0,5×104Pa灭菌30 min,4 ℃保存备用,使用时添加4×10-7生物素。
  1.4 内切纤维素酶浓缩酶液的制备
  利用重组毕赤酵母作为出发菌株,在BMGY/BMMY培养基中进行甲醇诱导6 d,8000 r/min离心,收集发酵液。再利用截留分子量为30ku的膜进行超滤浓缩,其中操作压力为8.0~10.0kPa(Millipore),超滤后用缓冲液洗膜,洗液与超滤液合并,得到浓缩酶液,4 ℃保存。
  1.5 内切纤维素酶酶活力测定
  测定内切纤维素酶活性采用DNS法。以Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH4.0)配制1% CMC-Na溶液做底物。其反应体系及反应条件为:用100μL的酶液与400 μL底物在70 ℃水浴下静置反应15min,煮沸1~2 min以结束反应,然后加入500 μLDNS试剂,沸水处理5 min,加水3mL混匀,在540nm波长下测定光吸收值。其中定义每分钟产生1μmol葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位(U)。
  1.6 稳定剂对内切纤维素酶热稳定性的作用
  将加有稳定剂的浓缩酶液在65 ℃下保温2 h后,稀释至适宜倍数,测其酶活力,用未加稳定剂的酶液作为对照组,将4℃放置的未经处理未添加稳定剂的酶的酶活力记作100%,从而计算酶活保留率。
  (1)多元醇类对内切纤维素酶热稳定性的影响:在内切纤维素酶浓缩酶液中,分别添加2%甘露醇、甘油、乙二醇、山梨醇、PEG6000,其他条件不变,测定酶活。
  (2)单糖和双糖对内切纤维素酶热稳定性的影响:分别添加2%葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖于内切纤维素酶浓缩酶液中,其他条件不变,测定酶活。
  (3)多糖对内切纤维素酶热稳定性的影响:在浓缩酶液中分别添加2%壳聚糖、糊精,0.2%CMC-Na、果胶、阿拉伯胶,其他条件不变,测定酶活。
  (4)金属离子对内切纤维素酶热稳定性的影响:在内切纤维素酶浓缩酶液中,分别添加浓度为10mmol/L的金属离子Mg2+、Ca2+、K+、Na+,保持其他条件不变,测定酶活。
  (5)蛋白质对内切纤维素酶热稳定性的影响:在浓缩酶液中分别添加2%牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、大豆蛋白,在其他条件不变的情况下,测定酶活。
  (6)通过正交试验确定复合稳定剂的最适配比:通过预试验和单因素试验,确定正交试验的各因素水平,本试验设半乳糖、糊精、明胶3个因素,每个因素设3个水平,进行热稳定性试验,以确定复合稳定剂的最适配比。试验用L9(34)正交表安排设计。
  1.7 统计分析
  采用SPSS Statistics 17.0软件进行单因素试验和正交试验的方差分析。
结果与分析
  2.1 液态酶制备
  收集粗发酵液,进行超滤,得到内切纤维素酶粗酶制剂,70 ℃下的酶活力达到607 U/mL,以此作为研究对象进行下一步添加剂的选择与优化研究。
  2.2 稳定剂对纤维素酶热稳定性的作用
  2.2.1 多元醇类对内切纤维素酶热稳定性的影响
  在内切纤维素酶浓缩酶液中分别添加2%甘露醇、甘油、乙二醇、山梨醇、PEG6000,其他条件不变,测定酶活。结果如图1所示。与对照相比,供试的几种多元醇均有不同程度的抑制作用,说明多元醇不利于维持内切纤维素酶活力的稳定性。
  2.2.2 单糖和双糖对内切纤维素酶热稳定性的影响
  单糖和双糖对内切纤维素酶热稳定性的影响见图2。由图2可知,葡萄糖及半乳糖对内切纤维素酶有明显的保护效果。
  为了进一步明确半乳糖和葡萄糖对酶的保护作用,分别向内切纤维素酶液中加入不同浓度的半乳糖或葡萄糖,65 ℃条件下处理2h后,测定酶活,结果如图3和图4所示。由图可知,半乳糖浓度在5%时,内切纤维素酶的酶活保留率最大,为153%,比对照高71%;而当葡萄糖浓度在3%时,内切纤维素酶的酶活保留率最高,为101%,比对照高56%。因此选择半乳糖作为稳定剂。
  2.2.3 多糖对内切纤维素酶热稳定性的影响
  在内切纤维素酶浓缩酶液中分别添加2%壳聚糖、麦芽糊精和0.2%CMC-Na、果胶、阿拉伯胶,酶活保留结果如图5所示。供试的多糖中糊精和阿拉伯胶对内切纤维素酶热稳定性均有一定的保护作用,但阿拉伯胶增加了溶液的黏度,妨碍酶与底物的结合,不利于内切纤维素酶发挥催化作用,故选用糊精做稳定剂。
  进一步研究不同浓度的糊精对内切纤维素酶热稳定性的影响,结果发现(图6),当糊精浓度为7%时,对内切纤维素酶热稳定性的保护作用最好,高达127%。比对照高出65%。
  2.2.4 金属离子对纤维素酶热稳定性的影响
  利用合适的金属离子稳定或者激活酶是酶工业上很实用的一种手段。在内切纤维素酶浓缩酶液中分别添加浓度为10mmol/L的金属离子镁、钙、钾、钠,酶活保留结果如图7所示。供试的几种金属离子的酶活保留率均低于对照,说明这些金属离子降低了内切纤维素酶的热稳定性。
  2.2.5 蛋白质对内切纤维素酶热稳定性的影响
  在内切纤维素酶浓缩酶液中分别添加2%牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、大豆蛋白,酶活保留结果如图8所示。明胶对内切纤维素酶的热稳定性效果最明显,故选明胶作为稳定剂。
  进一步研究不同浓度的明胶对内切纤维素酶热稳定性的影响,结果发现(图9),当明胶浓度为2%时,酶液的酶活保留率最高,达到111%,比对照高出25%。
  2.3 复合稳定剂对内切纤维素酶酶稳定性的影响
  根据以上单因素实验结果,设计3因素3水平L9(34)正交试验,3个因素及其3个水平分别为:A:半乳糖4%、5%、6%;B:明胶1%、2%、3%;C:糊精6%、7%、8%。试验结果利用SPSSStatistics17.0软件分析,结果见表1和表2。
  由表1可知,加入复合稳定剂后酶液的酶活均高于未添加稳定剂时的酶活,并且根据极差分析得到,3因子中对酶热稳定性影响由大到小依次为:半乳糖﹥明胶﹥糊精。
  由表2可知,因素“半乳糖、明胶、糊精”的P值都小于0.05但大于0.01,说明“半乳糖、明胶、糊精”因素对试验结果均有显著影响。在试验因子水平范围内,A1B1C3为适宜的试验组合。由于正交试验所有处理中均不包含该条件的组合,因此将该因子组合与正交表中酶活保留率最高的处理1在相同条件下进行验证试验,结果表明,组合A1B1C3的酶活保留率达到250.67%,比处理1酶活保留率高22%。因此,根据单因素试验及正交试验结果,确定复合稳定剂最佳配比为:半乳糖4%、明胶1%、糊精8%。
讨 论
  酶的稳定性是影响其在体外环境中有效发挥催化功能的一个主要限制因素,而液体酶制剂极易受环境条件影响,一般保存期较短。因此酶的热稳定性及贮存稳定性是液体酶制剂能否大规模生产和商品化的关键。而酶的保存期与其耐热性有很大关系,因此本研究将添加剂和酶液混合后在高温条件下保温2h,评价酶的稳定性,以此选择适宜长期贮存纤维素酶的稳定剂。
  酶高温条件下的失活主要是因为其构象的相对伸展造成的。本研究对象-内切纤维素酶源于一株嗜热真菌,并在酵母中进行了高水平表达,该酶能在70℃发挥最佳催化功能,但热稳定性不佳,说明添加底物对酶的天然构象起了保护作用,至少保护了活性中心免受高温的破坏。因此可以通过添加一些稳定剂或保护剂来改变酶的热动力学性质,维持天然酶在高温下的活性构象。
  多元醇、糖类、氨基酸及其衍生物、无机盐、多聚物等一般被称为蛋白质的共溶剂。共溶剂一般通过水替代作用、优先排阻作用或玻璃化作用维持蛋白质的稳定性。本研究发现多元醇和金属离子均降低了内切纤维素酶的热稳定性,不利于该酶的长期保存。糖类是蛋白质在溶液中和干燥状态下最好的稳定剂,不同性质的酶,其适宜的糖类稳定剂不同。本研究中的几种单糖、双糖和多糖在高温下对纤维素酶的热保护作用差异较大,只有半乳糖和环糊精在高温下对纤维素酶有显著的热保护效果。半乳糖分子存在较多的羟基,替代酶分子表面上水的羟基,使酶表面形成一层“水合层”,从而保持了酶天然结构和功能的完整性。而β-环糊精具有亲水性和多羟基的特点,可以抑制酶分子的聚集,从而提高酶的稳定性。除了半乳糖和环糊精,明胶也是本研究中筛选到的能增强内切纤维素酶热稳定性的优良保护剂,它通过防止酶分子间聚合变性来增强酶的热稳定性。本研究不仅通过添加一些保护剂提高了内切纤维素酶的稳定性,而且也开发出一种复合稳定剂,促进该酶的商品化生产及应用。

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